In 1863 werd begonnen met de onteigening van de voor de spoorlijn benodigde percelen grond. Voor de aanleg van de spoorlijn moesten 134 percelen worden aangekocht van 69 eigenaren. Er waren geen woningen die het veld hoefde te ruimen. Een aantal boeren maakte bezwaar tegen de aanleg en de onteigening omdat de spoorlijn de toegang tot de verschillende percelen bemoeilijkten. Ook eiste zij meerdere overwegen, zowel bij de Nieuwe Dijk en bij de Nieuwe Steeg. De meeste grond echter werd onteigend van de gemeente Best, nl 5.42.42 ha dat uiteindelijk een bedrag opleverde van f. 3.019,48. Vanaf 1864 werd begonnen aan de daadwerkelijke aanleg. Het traject Boxtel – Eindhoven werd op 1 juli 1866 in gebruik genomen.

De aanleg was in eerste instantie enkel spoor. Hier en daar waren extra rails gelegd zodat treinen in tegenovergestelde richting elkaar konden passeren.  Al snel na ingebruikname was er behoefte aan een dubbel spoor vanwege de samenloop van treinen van zowel Tilburg als van ’s-Hertogenbosch. In 1877 vonden de spoorwegen het noodzakelijk om op het emplacement in Best het spoor uit te breiden. In 1879 was het traject Boxtel-Eindhoven geheel dubbelsporig.

Op 1 juli 1866 was het dan eindelijk zover dat de eerste trein kon rijden op het traject tussen Boxtel en Eindhoven. De gemeente had fl 25,– beschikbaar gesteld voor de opening. De feestelijkheden werden echter afgelast in verband met zowel een cholera-epidemie als een veepest. Ondanks dat stonden er toch veel mensen langs de lijn om het nieuwe stalen monster te zien. Men was destijds nog geen machines gewend. Het enige mechaniek dat op het platte land bekend was , was een torenuurwerk. Vanaf die dag vertrokken er dagelijks 4 treinen richting Eindhoven en 4 treinen richting Boxtel.